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| 生物化學主要是研究生物大分子及其相互作用的科學，而生物大分子是存在于生物的基本單元—細胞、細胞間液或體液中的。生物大分子在活細胞內(nèi)的特定存在條件（pH、離子強度及其他生物大分子的相互制約）下，不僅能保持其結(jié)構(gòu)的完整而且能保持一定的生物活力。研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，至今尚未找到一種在細胞內(nèi)即可進行的方法。因此，人類若想研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，從而在分子水平上闡述生命現(xiàn)象的本質(zhì)，就必須先把生物大分子從細胞或機體內(nèi)完整、純凈且保持其活力地分離出來。因此，當我們將組織或細胞破碎并在體外（in vitro）分離純化和研究其生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能時，就必須時刻注意保持其結(jié)構(gòu)的完整性并維持活力！若想做到這一點，我們就必需從細胞破碎開始（生物大分子馬上失去了其賴以保持活力的制約條件），時刻注意為這些“離體”的生物大分子提供保持結(jié)構(gòu)完整，維持其活力的環(huán)境條件。 這種條件不是水、去離子水等能提供的。也就是說，我們要為生物大分子提供一個相對穩(wěn)定而適宜的pH環(huán)境、合適的離子強度及其他外界條件。同樣的，在組織和細胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)等細胞生物學，組織和病理學以及許多生命科學研究的體外培養(yǎng)和體外實驗中，也需要模擬器官、組織和細胞等的生理環(huán)境以維持其基本的代謝和生物特性或生命特征。毫無疑問的，在所有這些實驗中，所用液體的基礎(chǔ)溶液都是緩沖液。 緩沖液是溶液中維持溶液pH相對穩(wěn)定，能“中和”外加酸或堿的化學成分。一般來說，緩沖液是弱酸及其共軛堿（如乙酸和乙酸納）或弱堿及其共軛酸（如氨和氯化銨）組成的溶液，其中的弱酸及其共軛堿或弱堿及其共軛酸則稱緩沖對。 選擇緩沖液的依據(jù)是它的pKa值及其化學性質(zhì)。緩沖液在pH=pKa±1的范圍內(nèi)是zui有效的。超出這個范圍，無論是還是堿濃度都太小，不能有效抵抗外加酸或堿的影響。而溶液緩沖能力的大小，則取決于緩沖對兩個組分的濃度。選用緩沖液時，還應考慮緩沖液總的離子強度。由于溫度可影響某些弱酸和弱堿的解離，因此也影響pH值。所以配制緩沖液時務必要考慮環(huán)境溫度變化對緩沖液pH的影響。 在生命科學研究中，緩沖液的化學性質(zhì)特別重要。選用緩沖液時不僅要考慮緩沖對的溶解度、穩(wěn)定性，還要考慮與系統(tǒng)中其它離子或化學成分的相互作用，以及光吸收和對生物系統(tǒng)功能的潛在抑制作用或刺激作用。 使用緩沖液時應注意的一些事項 1.向緩沖液中添加一些必要的穩(wěn)定劑（如巰基保護劑——乙醇、多元醇、甘油、蔗糖、乙二醇、DDT等），以保護生物大分子重要的活性基團或空間結(jié)構(gòu)。 2.添加金屬離子或絡合劑，以保護對金屬離子敏感（需要或不需要）的生物大分子。有些酶需要兩價的金屬離子（如Ca++,Mg++,Mn++等）作為其輔因子；有些生物大分子則要時刻防范上述酶類（如DNase，Nuclease等）對它們的降解，故要向緩沖液中添加EDTA或EGTA等螯合劑，以保護它們不被降解。 3.添加蛋白酶抑制劑。如我們要研究蛋白質(zhì)分子，在分離純化他們的過程中，必須時刻防止他們被蛋白酶所水解。為此可向緩沖液中添加PMSF（苯甲基磺酰氟）或DFP（磷酸二異丙基氟），亮抑肽等。它們可分別抑制哺乳動物蛋白酶或絲氨酸蛋白酶的活力。 4.蛋白質(zhì)添加劑：生物大分子需要有一定的濃度，才能保持其完整的空間構(gòu)像。因此，經(jīng)過一系列分離純化步驟而zui終得到純酶制品時，有時其濃度很低。為保持這類濃度很稀的純酶的活力，往往要向這類酶制品（特別是一些商售的限制性核酸內(nèi)切酶）中人為地添加一些蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白（Casein）等，從而既保護了目的酶的空間構(gòu)象又不影響其活力。 5.滲投壓：在組織和細胞的體外培養(yǎng)、保存或洗滌等實驗中，除了溶液的酸堿度，營養(yǎng)成分和與其它離子或化學成分的相互作用外，還要注意液體的滲投壓。低滲可導致溶血或細胞膜破裂，高滲引起細胞皺縮或抑制細胞代謝。有的緩沖對濃度稍高，即可因其與其它離子或化學成分相互作用而影響溶液的穩(wěn)定性或?qū)毎墓δ墚a(chǎn)生副作用，因此，為了不使某一緩沖對的濃度過高，可以在同一個溶液中添加多個不同的緩沖系統(tǒng)；為了保持溶液處于等滲狀態(tài)，避免高滲或低滲的出現(xiàn)，常通過添加氯化鈉等中性鹽的方法調(diào)整溶液的滲投壓，如在磷酸緩沖液（PB）中添加氯化鈉配制成磷酸鹽緩沖液(PBS)。 |
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